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本发明涉及一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，属于生物分析技术领域。解决了现有技术中检测凝血酶活性的方法，大多存在着需要荧光标记、稳定性差、步骤繁琐、成本高等缺点的问题。本发明的方法，步骤如下：将待测物加入检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度获得凝血酶的浓度；其中，检测体系由氧化石墨烯、苝衍生物探针、凝血酶核酸适配体、溶剂和缓冲液组成。该方法，所需材料成本低，无需大型仪器，便捷高效，构建方法简单，无需复杂程序，反应迅速，基本无毒害，反应条件温和，选择性好，且稳定性好、灵敏度高，在0～6mU/mL范围内有很好的线性响应，检测限低至0.082mU/mL。